熒光顯微鏡是利用一個高發光效率的點光源，經過濾色系統發出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發光、激發標本內的熒光物質發射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結構和功能以及化學成分等的研究。

熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。熒光光源——般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發出各種波長的光，但每種熒光物質都有一個產生很強熒光的激發光波長，所以需加用激發濾片(一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發濾片)，僅使一定波長的激發光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質被激發光照射后，在很短時間內發射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。

它的作用有二：一是吸收和阻擋激發光進入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現出專一的熒光色彩。兩種濾光片要選擇配合使用。