熒光顯微鏡不是通過普通光源的照射來觀察標本，而是利用一定波長的光（通常是紫外光、藍紫光）在顯微鏡下激發標本中的熒光物質發出熒光，所以，熒光顯微鏡光源的作用不是直接照射，而是作為能量源激發標本內部的熒光物質。我們之所以能觀察到標本，是由于光源的照射，而是標本中的熒光物質吸收激發光能后呈現的熒光現象。

熒光顯微鏡的原理是什么?

與普通光學顯微鏡不同，熒光顯微鏡不是通過普通光源的照射來觀察標本，而是利用一定波長的光（通常是紫外光、藍紫光）在顯微鏡下激發標本中的熒光物質發出熒光，所以，熒光顯微鏡光源的作用不是直接照射，而是作為能量源激發標本內部的熒光物質。我們之所以能觀察到標本，是由于光源的照射，而是標本中的熒光物質吸收激發光能后呈現的熒光現象。

由此可見，熒光顯微鏡的主要特點是它的光源可以在特定波長范圍內提供大量的激發光，使被測樣品中的熒光物質能夠獲得被測物的激發光。必要的強度。同時，熒光顯微鏡必須有相應的濾光系統。

熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學的重要工具。它由超高壓光源、濾光系統（包括激發和加壓濾板）、光學系統和照相系統等主要部件組成。它利用一定波長的光激發標本發射熒光。

激發熒光的方式：根據光的波長范圍分為UV激發法（使用紫外照射法）和BV激發法（使用藍紫光）。紫外激發法使用短于 400 nm 的近紫外光進行激發。該方法沒有可見的激發光，因此觀察到的熒光表現出染料的固有熒光，很容易區分標本上的特異性熒光和背景組織的自發熒光。

BV激發法是從紫外光激發到以404nm和434nm為中心的藍光。這種方法使用藍光照射標本，因此熒光觀察系統的截止濾光片必須使用能夠完全阻擋藍光并完全通過所需的綠色和黃色熒光的濾光片。用于熒光抗體測定的熒光染料。激發光的Z大吸收波長與熒光的Z大發射波長比較接近，所以BV激發法中使用的濾光片必須使用銳截止濾光片。該方法可以使用藍光作為激發光，因此熒光染料的吸收效率高，可以獲得更亮的圖像。缺點是500nm以下看不到熒光，500nm以上會使整個圖像呈現黃色。在熒光抗體法中，大部分熒光染料都是獨特的。因此，在討論細微特異性時，上述 BV 激發方法的缺點往往影響很大。

綜上所述，熒光顯微鏡的照明根據聚光鏡的結構和激發光的波長可以分為以下三點。

1.從熒光圖像的對比度要求來看，紫外激發的暗場聚光鏡適合照明。

2.考慮到圖像的亮度，BV激發濾光片的暗場觀察效率高。

3.UV激發濾光片暗場觀察和BV激發暗場聚光鏡照明的特點可以說是介于這兩種照明方式之間，但前者的濾光片暗場特性更強，顯示的圖像更亮，對比度小；后者保留了暗場光路的特性，因此顯示圖像更暗，對比度提高。實際使用熒光顯微鏡時，應使用適合標本要求的照明方法進行觀察。

必須指出的是，即使是用對比度好的紫外激發暗場聚光器照射時，被試樣折射或散射的部分紫外激發光也會進入物鏡，使加膠面和光學玻璃中的加膠面光學系統會受到激發的影響，產生的自發熒光會使圖像的響應變差。因此，必須在目鏡前使用吸收紫外線的濾光片作為截止濾光片。